骨質(zhì)疏松癥是一種以骨強(qiáng)度受損為特征的骨骼疾病。其病因很多，最終結(jié)果為成骨過程低于破骨過程，骨量和骨質(zhì)量下降。成骨細(xì)胞是骨質(zhì)生發(fā)、形成的物質(zhì)基礎(chǔ)，只有其不斷的分裂增殖才可以產(chǎn)生豐富的膠原基質(zhì)，通過礦化作用形成更多骨質(zhì)。通過刺激成骨細(xì)胞增殖、促進(jìn)骨組織形成是治療骨質(zhì)疏松的主要方法之一。有研究認(rèn)為虎骨能增加骨質(zhì)疏松大鼠的血鈣水平、提高骨密度、增加骨強(qiáng)度及韌性，同時減少骨吸收，這些作用與天然虎骨一致。但人工虎骨促進(jìn)成骨作用的細(xì)胞機(jī)制尚未明確。金天格膠囊的主要成份為人工虎骨粉。本研究觀察金天格膠囊對成骨細(xì)胞的影響，探討其對成骨細(xì)胞作用的機(jī)理。 

    細(xì)胞培養(yǎng)：采用改良的胰酶．膠原酶序貫消化法培養(yǎng)人成骨樣細(xì)胞。骨科手術(shù)取成人(30～50歲無骨代謝疾病的骨折患者)的松質(zhì)骨l一2 g，去除外膜結(jié)締組織，剪成2mm 大小碎粒，用胎牛血清(PBS)沖洗3次，用0，25％胰酶．ED—TA 37℃消化兩次，每次20min，棄去消化液，繼用l mg／ml IV型膠原酶于37~C消化5次，反復(fù)振搖，每次20min，棄除前兩次消化上清液，取最后3次消化液，離心(1200fmin)10min，棄上清液后用含l5％PBS的MEM 培養(yǎng)液重懸細(xì)胞，接種于75cm~75cm培養(yǎng)瓶，于37℃，25％CO 條件下培養(yǎng)，次日換液棄去懸浮細(xì)胞，每隔兩日換液1次；消化后的骨碎片可貼于25cm~25cm培養(yǎng)瓶壁(25—40個碎骨粒／瓶)，加入含15％ PBS的MEM 培養(yǎng)液，37~C，25％CO 條件下培養(yǎng)，l周后換液，以后隔兩日換液1次，即得到酶消化法及骨片貼附法所獲得的人成骨樣細(xì)胞(HOB)。 

    細(xì)胞鑒定：采用倒置顯微鏡和電鏡進(jìn)行形態(tài)學(xué)觀察，采用改良Gomon鈣一鈷法做堿性磷酸酶染色。 

    藥液配制：應(yīng)用金天格膠囊(金花企業(yè)股份有限公司高新制藥廠生產(chǎn))lg，加入含l5％PBS的MEM培養(yǎng)液(pH值為7．3．7．4，過濾除菌)lOml中，用0．451~m濾器除菌，配成濃度為0．1g／ml的溶液。依上法可配制成濃度為5p~g／ml、10l~g／ml、20~g／ml的金天格膠囊藥液。 

    統(tǒng)計方法：定量指標(biāo)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示。采用x 檢驗或t檢驗，P<0．05為有統(tǒng)計學(xué)意義。 

    結(jié)果：細(xì)胞形態(tài)觀察用酶消化法獲得的HOB，倒置顯微鏡下觀察，呈紡錘形、多邊形及梭形，呈”鋪路石ll{羊排列，局部有密集的細(xì)胞團(tuán)。電鏡下觀察，呈類圓形，表面有微絨毛突起，細(xì)胞中富含較多線粒體、擴(kuò)張的粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)及大量的分泌空泡，細(xì)胞膜下可見豐富的顆粒狀電子致密物，細(xì)胞核較大，可見核膜內(nèi)陷及大的核仁。符合成骨細(xì)胞特點(diǎn)。 

    細(xì)胞染色：堿性磷酸酶染色細(xì)胞胞漿內(nèi)有棕黑色沉淀并掩蓋細(xì)胞核上，染色呈強(qiáng)陽性，符合成骨細(xì)胞特點(diǎn)。 

    藥物作用效果：在不同藥物濃度下觀察各指標(biāo)結(jié)果上表顯示金天格膠囊藥液可以明顯刺激成骨細(xì)胞的增殖，與不用藥組對比有顯著差異，并隨藥物濃度的增加，成骨細(xì)胞數(shù)明顯增多(P<0．05)；反映成骨細(xì)胞活性的AKP、BGP隨藥物濃度的增加也相應(yīng)升高，與不用藥組對比有顯著差異(P<0．05)；反映破骨細(xì)胞活性的PYD則隨藥物濃度的增加而相應(yīng)下降，與不用藥組對比有顯著差異。 

    本研究聯(lián)合檢測金天格膠囊藥液干預(yù)試驗后的AKP、BGP、PYD的含量并進(jìn)行細(xì)胞計數(shù)，結(jié)果表明加藥后細(xì)胞數(shù)隨藥物濃度增加而增加，AKP、BGP水平也相應(yīng)提高，Ⅲ組的AKP、BGP水平較I組和II組增加明顯，與不用藥組對比存在統(tǒng)計學(xué)差異(P<0．05)，說明金天格膠囊有直接刺激成骨細(xì)胞增殖及加強(qiáng)其活性的作用，并且提高金天格膠囊的濃度(用量)有利于藥效的發(fā)揮。再者，標(biāo)本檢測中發(fā)現(xiàn)的PYD，可能是成骨細(xì)胞傳代過程中部分細(xì)胞破壞，釋放某種物質(zhì)降解膠原產(chǎn)生的，本研究顯示加大金天格膠囊藥液的濃度可使培養(yǎng)液中PYD的濃度下降(P<0．05)，這說明金天格膠囊也有抑制破骨的作用。金天格膠囊的原料藥來自動物骨骼，含豐富的骨膠原蛋白，是參與骨形成的重要有機(jī)基質(zhì)翻，同時還含有參與骨形成的重要無機(jī)基質(zhì)。本研究顯示金天格膠囊直接刺激成骨細(xì)胞增殖及加強(qiáng)其活性的作用可能是所含的骨膠原蛋白、鈣、磷及微量元素等共同作用的結(jié)果。 

    (本文節(jié)選自《金天格膠囊對成骨細(xì)胞作用的研究》)

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